1 等度淋洗與梯度淋洗

進(jìn)行高效液相色譜與離子色譜分析時(shí)，常用兩種洗脫方式，即等度淋洗與梯度淋洗。其中等度淋洗在分析全過程中流動(dòng)相的組成不變。而梯度淋洗中流動(dòng)相組成隨運(yùn)行過程是變化的（例如氫氧根體系中氫氧化鉀濃度由15mM增至50mM）。

下圖為幾種不同的梯度形狀。其中曲線梯度較為不常見。

目前許多實(shí)驗(yàn)室對梯度淋洗有很大偏見。他們偏愛等度淋洗的原因有以下幾點(diǎn)：

①一些實(shí)驗(yàn)室尚不具備支持梯度淋洗的色譜儀（只有一個(gè)泵且沒比例閥）。

②梯度淋洗更復(fù)雜，似乎更難建立新方法。

③某些HPLC檢測器(如示差折光檢測器)不能使用梯度淋洗。

④每次運(yùn)行梯度淋洗后需重新平衡色譜柱，耗時(shí)較長。

⑤不同設(shè)備的分離結(jié)果可能不同，所以梯度淋洗法移植時(shí)會(huì)出現(xiàn)保留時(shí)間差異。

⑥梯度淋洗中的基線噪聲和基線漂移更大，更容易受到試劑純度的影響。

⑦某些色譜柱或流動(dòng)相不適于梯度淋洗。

實(shí)際上，梯度淋洗分離方法的建立和日常操作與等度淋洗相比并不太難。而且很多分離只適于使用梯度淋洗。

2 梯度淋洗的優(yōu)勢

用等度淋洗時(shí)，由于流動(dòng)相全程保持不變，如果待分析物，的保留差異很大，則會(huì)出現(xiàn)弱保留組分扎堆洗脫且強(qiáng)保留組分很晚才洗脫，從而無法獲得滿意的分離。

為了比較等度淋洗與梯度淋洗的不同，我們使用同一根色譜柱分離相同的樣品，下圖是等度淋洗與梯度淋洗的對比譜圖，上半部分為等度淋洗曲線，下半部分為梯度淋洗曲線。通過對比我們可以發(fā)現(xiàn)，等度淋洗時(shí)1~6號峰分離度不太理想，13號峰保留時(shí)間過長，而在梯度淋洗時(shí)，為了改善1~6號峰的分離，我們采用較低的淋洗液濃度，為了快速洗脫強(qiáng)保留的13號峰，我們在6號峰后提高了淋洗液濃度，使得13號峰由原來的80分鐘提前到40分鐘。由此可見，梯度淋洗可有效改善弱保留組份分離度，快速洗脫強(qiáng)保留組份。此外，等度淋洗時(shí)，弱保留組份峰形比較窄而強(qiáng)保留組份峰形較寬，梯度淋洗時(shí)增強(qiáng)洗脫能力可以使強(qiáng)保留組份也獲得尖銳的峰形。

3 使用梯度淋洗時(shí)的注意點(diǎn)

3.1 基線漂移

在HPLC中，不同流動(dòng)相（水、甲醇、乙腈）對于紫外吸收的程度不同，導(dǎo)致梯度淋洗時(shí)產(chǎn)生基線漂移，且不可避免。

在碳酸鹽體系離子色譜中，抑制產(chǎn)物是碳酸，碳酸濃度不同其電導(dǎo)也不同。故梯度淋洗會(huì)產(chǎn)生基線漂移，且不可避免。

對于氫氧根淋洗液和甲烷磺酸淋洗液，抑制產(chǎn)物是水，理論上在梯度淋洗時(shí)不會(huì)產(chǎn)生基線漂移；而實(shí)際上由于試劑純度以及抑制不完全等原因，也是存在基線漂移的。

3.2 流動(dòng)相平衡

每次梯度淋洗結(jié)束時(shí)，流動(dòng)相的組成已經(jīng)與分析開始時(shí)大不相同了。為了下一次的梯度淋洗，必須用初始濃度的流動(dòng)相對色譜柱進(jìn)行徹底平衡后，再進(jìn)行梯度淋洗。

色譜柱平衡時(shí)間不足時(shí)，色譜圖早期被洗脫的峰的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生改變，而后期被洗脫的峰通常不受影響。

3.3 流動(dòng)相濃度的滯后現(xiàn)象

當(dāng)確定了梯度淋洗程序后，開始梯度淋洗，但由于實(shí)現(xiàn)梯度淋洗的儀器設(shè)備結(jié)構(gòu)或電子控制系統(tǒng)等多種原因，使得我們實(shí)際觀測到底梯度淋洗向后平移了一段時(shí)間，此現(xiàn)象稱為梯度系統(tǒng)的滯后時(shí)間。

使用相同的梯度淋洗程序，對于同一個(gè)樣品，在不同的色譜儀上進(jìn)行梯度淋洗，由于儀器結(jié)構(gòu)、電路控制以及管線長度的差異，表現(xiàn)出的滯后時(shí)間往往不同。

4 梯度淋洗的類型

傳統(tǒng)上，梯度淋洗分為高壓梯度（也叫內(nèi)梯度）和低壓梯度（也叫外梯度）。另外，在離子色譜領(lǐng)域提出淋洗液發(fā)生器的概念后，使用淋洗液發(fā)生器時(shí)也可以進(jìn)行梯度淋洗。

4.1 高壓梯度（內(nèi)梯度）

高壓梯度又稱內(nèi)梯度，采用多個(gè)高壓泵將不同的流動(dòng)相增壓后送入混合室混合后送入色譜柱。流動(dòng)相中有幾種變化組分就稱為幾元梯度。二元梯度淋洗需要兩臺高壓輸液泵；三元梯度淋洗需要三臺高壓輸液泵；每臺高壓輸液泵的輸出量由程序控制，按照設(shè)定程序?qū)⒉煌康娜軇┧偷交旌鲜一旌?，產(chǎn)生任意形式的梯度淋洗曲線。高壓梯度通常以二元高壓梯度最為常見。

下圖為二元高壓輸液系統(tǒng)示意圖。

泵A和泵B出來的流動(dòng)相在混合器里面混合的時(shí)候，都是處于高壓狀態(tài)，這時(shí)候，流動(dòng)相對氣體溶解度較高，流動(dòng)相中不容易析出氣泡，從而避免導(dǎo)致液相色譜壓力波動(dòng)、流速不準(zhǔn)、基線波動(dòng)等種種問題。

4.2 低壓梯度（外梯度）

低壓梯度又稱外梯度，是在常壓下將流動(dòng)相的不同組分混合后再用高壓輸液泵送入色譜柱的方法，利用電磁比例閥控制不同溶劑的流量變化，使溶劑按不同比例被輸送入到混合室中混合，然后用一臺高壓輸液泵將混合好的流動(dòng)相輸送到色譜柱中。

低壓梯度通常以四元低壓梯度最為常見。

流動(dòng)相對氣體的溶解度較低，如果流動(dòng)相中溶解的氣體比較多的話，在混合時(shí)就可能有小氣泡形成，導(dǎo)致壓力波動(dòng)等種種問題。氣泡永遠(yuǎn)是液相色譜的天敵。

下圖為四元低壓輸液系統(tǒng)示意圖。

低壓梯度一定要配脫氣機(jī)，先對流動(dòng)相進(jìn)行在線脫氣，才能用電磁比例閥進(jìn)行混合，要不然很容易產(chǎn)生氣泡。而高壓梯度一般情況下可以不用配在線脫氣機(jī)就能在線混合，運(yùn)行梯度方法。

高壓梯度的優(yōu)勢：

優(yōu)勢1：混合精確性高

從上面的介紹可以看到，兩種梯度體系的混合方式完全不同。高壓梯度相當(dāng)直觀，通過分別控制兩個(gè)泵的流速，就能夠準(zhǔn)確控制兩種流動(dòng)相的比例。比如在1ml/min的流速下，要達(dá)到A：B兩種流動(dòng)相70：30的混合比例，那就設(shè)置A泵流速0.7ml/min，B泵流速0.3ml/min就可以了。當(dāng)然這些都是系統(tǒng)和軟件自動(dòng)完成的。只要做到泵流速準(zhǔn)確，比例就能準(zhǔn)確。

而低壓梯度則通過電磁比例閥來控制混合比例，那比例閥又是如何工作的呢？

一般來說，比例閥是通過控制入口通道分別打開時(shí)間的長短來控制混合比例的。

舉個(gè)例子可能更容易理解，仍然是A：B兩種流動(dòng)相70：30的混合比例。為了達(dá)到這個(gè)效果，B、C、D三個(gè)通道都關(guān)閉，A通道打開7ms，這時(shí)候進(jìn)入系統(tǒng)的都是A；然后，A、C、D關(guān)閉，B通道打開3ms，這時(shí)候進(jìn)入系統(tǒng)的都是B。這樣就得到了70/30的流動(dòng)相的比例。大家能感覺出來，進(jìn)入系統(tǒng)的流動(dòng)相其實(shí)是一段A、一段B這樣的。如果兩種流動(dòng)相比例比較懸殊（比如某組分只占有1%），這種混合方式的誤差相對比較大。

優(yōu)勢2：延遲體積小

使用高壓梯度時(shí)，流動(dòng)相混合后，經(jīng)過混合器、壓力傳感器、阻尼器，放空閥，然后進(jìn)入進(jìn)樣器。

反觀低壓梯度，流動(dòng)相混合后要經(jīng)過整個(gè)泵頭(包括主動(dòng)入口閥、兩個(gè)泵腔、出口閥、管路等等)，才能到達(dá)進(jìn)樣器。

一般來說，我們把流動(dòng)相從混合開始，最后到達(dá)柱頭這段體積叫延遲體積。流動(dòng)相梯度的變化要到色譜柱頭，才能夠?qū)Ψ蛛x產(chǎn)生影響，所以有一定的延遲。延遲體積越大，梯度的變化到達(dá)柱頭的時(shí)間越長，導(dǎo)致分析時(shí)間越長。

我們可以看到，高壓梯度先天地決定了其延遲體積遠(yuǎn)小于低壓梯度。這就決定了在色譜分析時(shí)間要求很短的梯度方法中，比如各種小粒徑的色譜柱的快速分析方法，都采用高壓梯度方法。

不同品牌、類型的液相之間的延遲體積差異，是方法轉(zhuǎn)移后出現(xiàn)結(jié)果跟以前不一樣了的最大的原因之一。

低壓梯度的優(yōu)勢：

高壓梯度這么多優(yōu)勢，但在實(shí)際上，還是低壓梯度用得更多一些。

低壓梯度的優(yōu)勢是：便宜。

低壓梯度只需要一個(gè)輸液泵就能運(yùn)行梯度條件，，高壓梯度最低需要兩個(gè)泵才能運(yùn)行梯度。在運(yùn)行方法條件不是很苛刻的時(shí)候，低壓梯度能達(dá)到跟高壓梯度一樣的分析效果，而價(jià)格可能要便宜得多。而且只有一個(gè)泵，后期保養(yǎng)成本也低。

因?yàn)楸阋?，所以市場保有量更大，很多?biāo)準(zhǔn)方法都是在低壓梯度下開發(fā)的。用高壓梯度需要進(jìn)行方法移植。

如果用一些三元甚至更高元梯度的方法，四元低壓梯度可以直接拿來用，高壓梯度需要購置三個(gè)甚至四個(gè)泵，成本進(jìn)一步提高。

四元低壓梯度可以在進(jìn)樣程序中直接設(shè)置走完序列后沖洗瓶子；而高壓梯度要達(dá)成這樣的方法，需要購置閥控或者更多的泵。

4.3 離子色譜淋洗液發(fā)生器產(chǎn)生的梯度淋洗

離子色譜使用的流動(dòng)相以酸堿鹽的水溶液為主，傳統(tǒng)的配制方法是稱量試劑并溶解定容。淋洗液發(fā)生器通過電解在線產(chǎn)生高純度淋洗液，并支持梯度程序，是離子色譜發(fā)展中的重大跨越。

此處以KOH淋洗液發(fā)生器為例介紹淋洗液發(fā)生器的原理。淋洗液發(fā)生器通電時(shí)，陽極電解產(chǎn)生氫離子及氧氣，氫離子和罐中的氫氧根離子反應(yīng)生成水，導(dǎo)致罐中鉀離子（陽離子）比氫氧根離子（陰離子）數(shù)量多。多出來的鉀離子在電場及滲析作用的驅(qū)動(dòng)下通過陽離子膜到達(dá)氫氧化鉀發(fā)生室。陰極在氫氧化鉀發(fā)生室的底部，電解產(chǎn)生氫氧根離子和氫氣。

隨著超純水不斷流入氫氧化鉀發(fā)生室，鉀離子和氫氧根離子以及氫氣隨著水流入CR-ATC（主要作用是去除雜質(zhì)陰離子）和脫氣盒，在脫氣盒中氫氣被去除。所產(chǎn)生的KOH溶液的濃度由施加電流與去離子水的流速?zèng)Q定。根據(jù)法拉第電解定律，在恒定流速下，施加電流和所產(chǎn)生的KOH濃度之間呈正比，可通過控制所加的電流得到準(zhǔn)確濃度的KOH淋洗液，因此也可以實(shí)現(xiàn)梯度淋洗。

操作鼠標(biāo)即可設(shè)置淋洗液的濃度梯度，有效地簡化了操作和縮短了運(yùn)行時(shí)間，使其與等度淋洗一樣方便，此項(xiàng)技術(shù)被稱為“只加水”離子色譜技術(shù)。

5 總結(jié)

進(jìn)行梯度淋洗可以達(dá)到以下目的：縮短分析周期；提高分離能力；峰型得到改善；增加靈敏度，但通常會(huì)引起基線漂移。

在離子色譜中，使用淋洗液發(fā)生器產(chǎn)生的梯度淋洗精度通常高于高壓及低壓梯度，推薦使用。

在液相色譜中，高壓梯度及低壓梯度各有優(yōu)勢，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件及預(yù)算進(jìn)行選配。

6 參考文獻(xiàn)

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于世林.《圖解高效液相色譜技術(shù)與應(yīng)用》科學(xué)出版社

R.施奈德，J.L.格萊吉克 著 王杰 趙嵐峰 王樹力 丁潔 譯 《實(shí)用高效液相色譜法的建立》（第二版）科學(xué)出版社

青島睿譜分析儀器有限公司 《離子色譜實(shí)用手冊》

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